一、材料、設備及試劑

（一）材料

含 pBS 的 E. coli DH5α 或 JM 系列菌株，1.5ml 塑料離心管 (又稱 eppendorf 管)，離心管架。

（二）設備

微量取液器 (20μl,200μl,1000μl)，臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器 (滅菌鍋)，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。

（三）試劑

1. LB 液體培養基 (Luria-Bertani)：稱取蛋白胨 (Tryptone) 10g，酵母提取物 (Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于 800ml 去離子水中，用 NaOH 調 pH 至 7.5，加去離子水至總體積 1 升，高壓下蒸氣滅菌 20 分鐘。

2. LB 固體培養基：液體培養基中每升加 12g 瓊脂粉，高壓滅菌。

3. 氨芐青霉素 (Ampicillin, Amp) 母液：配成 50mg/ml 水溶液，-20℃保存備用。

4. 溶菌酶溶液：用 10mmol/L Tris?Cl (pH8.0) 溶液配制成 10mg/ml，并分裝成小份 (如 1.5ml) 保存于 - 20℃，每一小份一經使用后便予丟棄。

5. 3mol/l NaAc (pH5.2)：50ml 水中溶解 40.81g NaAc?3H2O，用冰醋酸調 pH 至 5.2，加水定容至 100ml，分裝后高壓滅菌，儲存于 4℃冰箱。

6. 溶液 Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液 Ⅰ 可成批配制，每瓶 100ml，高壓滅菌 15 分鐘，儲存于 4℃冰箱。

7. 溶液 Ⅱ：0.2mol/L NaOH (臨用前用 10mol/L NaOH 母液稀釋)，1％SDS。

8. 溶液 Ⅲ：5mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定容至 100ml，并高壓滅菌。溶液終濃度為：K+ 3mol/L，Acˉ 5mol/L。

9. RNA 酶 A 母液：將 RNA 酶 A 溶于 10mmol/L Tris?Cl (pH7.5)，15mmol/L NaCl 中，配成 10mg/ml 的溶液，于 100℃加熱 15 分鐘，使混有的 DNA 酶失活。冷卻后用 1.5ml eppendorf 管分裝成小份保存于 - 20℃。

10. 飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物，這些產物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導致 RNA 和 DNA 的交聯，應在 160℃用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入 0.1％的 8 - 羥基喹啉 (作為抗氧化劑)，并用等體積的 0.5mol/L Tris?Cl (pH8.0) 和 0.1mol/L Tris?Cl (pH8.0) 緩沖液反復抽提使之飽和并使其 pH 值達到 7.6 以上，因為酸性條件下 DNA 會分配于有機相。

11. 氯仿：按氯仿：異戊醇＝24:1 體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現的泡沫。按體積 / 體積＝1:1 混合上述飽和酚與氯仿即得酚 / 氯仿 (1:1)。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應戴手套。

12. TE 緩沖液：10mmo/L Tris?Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。高壓滅菌后儲存于 4℃冰箱中。

13. STET：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)，5% Triton X-100。

14. STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。

15. 電泳所用試劑：（1）TBE 緩沖液 (5×)：稱取 Tris 54g，硼酸 27.5g，并加入 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定溶至 1000ml。（2）上樣緩沖液 (6×)：0.25% 溴酚藍，40% (w/v) 蔗糖水溶液。

二、操作步驟

（一）細菌的培養和收集

將含有質粒 pBS 的 DH5α 菌種接種在 LB 固體培養基 (含 50μg/ml Amp) 中，37℃培養 12-24 小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到 5ml LB 液體培養基 (含 50μg/ml Amp) 中，37℃振蕩培養約 12 小時至對數生長后期。

（二）質粒 DNA 少量快速提取

質粒 DNA 小量提取法對于從大量轉化子中制備少量部分純化的質粒 DNA 十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣，所得 DNA 有一定純度，可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。

1. 煮沸法

1. 將 1.5ml 培養液倒入 eppendorf 管中，4℃下 12000ｇ離心 30 秒。

2. 棄上清，將管倒置于衛生紙上幾分鐘，使液體流盡。

3. 將菌體沉淀懸浮于 120ml STET 溶液中，渦旋混勻。

4. 加入 10ml 新配制的溶菌酶溶液 (10mg/ml)，渦旋振蕩 3 秒鐘。

5. 將 eppendorf 管放入沸水浴中，50 秒后立即取出。

6. 用微量離心機 4℃下 12000g 離心 10 分鐘。

7. 用無菌牙簽從 eppendorf 管中去除細菌碎片。

8. 取 20ml 進行電泳檢查。

[注意] 1. 對大腸桿菌可從固體培養基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質粒 DNA。

2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，濃度高時，細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。

3. 提取的質粒 DNA 中會含有 RNA，但 RNA 并不干擾進一步實驗，如限制性內切酶消化、亞克隆及連接反應等。

2. 堿法

1. 取 1.5ml 培養液倒入 1.5ml eppendorf 管中，4℃下 12000g 離心 30 秒。

2. 棄上清，將管倒置于衛生紙上數分鐘，使液體流盡。

3. 菌體沉淀重懸浮于 100μl 溶液 Ⅰ 中 (需劇烈振蕩)，室溫下放置 5-10 分鐘。

4. 加入新配制的溶液 Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒 eppendorf 管數次，以混勻內容物 (千萬不要振蕩)，冰浴 5 分鐘。

5. 加入 150μl 預冷的溶液 Ⅲ，蓋緊管口，并倒置離心管，溫和振蕩 10 秒，使沉淀混勻，冰浴中 5-10 分鐘，4℃下 12000g 離心 5-10 分鐘。

6. 上清液移入干凈 eppendorf 管中，加入等體積的酚 / 氯仿 (1:1)，振蕩混勻，4℃下 12000g 離心 5 分鐘。

7. 將水相移入干凈 eppendorf 管中，加入 2 倍體積的無水乙醇，振蕩混勻后置于 - 20℃冰箱中 20 分鐘，然后 4℃下 12000g 離心 10 分鐘。

8. 棄上清，將管口敞開倒置于衛生紙上使所有液體流出，加入 1ml 70％乙醇洗沉淀一次，4℃下 12000g 離心 5-10 分鐘。

9. 吸除上清液，將管倒置于衛生紙上使液體流盡，真空干燥 10 分鐘或室溫干燥。

10. 將沉淀溶于 20μl TE 緩沖液 (pH8.0，含 20μg/ml RNaseA) 中，儲于 - 20℃冰箱中。

[注意] 1. 提取過程應盡量保持低溫。

2. 提取質粒 DNA 過程中除去蛋白很重要，采用酚 / 氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好，要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。

3. 沉淀 DNA 通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可使 DNA 沉淀。沉淀 DNA 也可用異丙醇 (一般使用等體積)，且沉淀全，速度快，但常把鹽沉淀下來，所以多數還是用乙醇。

3. Wizard 少量 DNA 純化系統

Promega 公司的 Wizard 少量 DNA 純化系統可快速有效的抽提質粒 DNA，整個過程只需 15 分鐘。提取的質粒可直接用于 DNA 測序、酶切分析和體外轉錄等。

該系統中所含試劑和柱子可以用于 50 次 1-3ml 質粒培養液的分離和純化，試劑包括 10ml 細胞懸浮液，10ml 細胞裂解液；10ml 中和液，50ml Wizard 少量 DNA 純化樹脂，50ml 柱洗液（使用前加 95% 乙醇至 120ml) 和 50 支 Wizard 微型柱。

1. 1-3ml 過夜培養細胞液 4℃下 12000g 離心 1-2 分鐘。

2. 去除上清液，菌體細胞懸浮于 200μl 細胞懸浮液中，充分混合，并移入 eppendorf 管中。

3. 加 200μl 細胞裂解液，顛倒離心管數次，直到溶液變清亮。

4. 加 200μl 中和液，顛倒離心管數次。

5. 4℃下 12000g 離心 5 分鐘，取上清液于新的 eppendorf 管中。

6. 加 1ml Wizard 少量 DNA 純化樹脂，顛倒離心管數次以充分混勻。

7. 取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒與 Wizard 微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，并用注塞輕推，使混合物進入微型柱。

8. 將注射器與微型柱分開，取出注塞，再將注射筒與微型柱相連，加入 2ml 柱洗液，并用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。

9. 取出微型柱置于 eppendorf 管中，離心 2 分鐘以除去微型柱中的柱洗液。

10. 將微型柱放在一個新 eppendorf 管中，加 50μl TE (或水) 于微型柱中，靜止 1 分鐘后，4℃下 12000g 離心 20 秒。

11. 丟棄微型柱，將 eppendorf 管中的質粒 DNA 貯于 4℃或 - 20℃冰箱。

[注意] 樹脂使用前應充分混勻，如有結晶，可將樹脂用 25-37℃水浴處理 10 分鐘。