動(dòng)物植物組織mRNA 提取試劑和方法步驟

一、實(shí)驗(yàn)材料  水稻葉片或小鼠肝組織。 

二、實(shí)驗(yàn)室儀器：  研缽，冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測(cè)儀，電泳儀，電泳槽。

三、實(shí)驗(yàn)試劑
  1 、無  RNA  酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（ 180 ℃  2  小時(shí)）裝蒸餾水，然后加入  0.01% 的 DEPC （體積 / 體積），處理過夜后高壓滅菌。 

2 、75% 乙醇：用  DEPC  處理水配制  75% 乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻  璃瓶中，存放于低溫冰箱。

3、 1 ×層析柱加樣緩沖液； 20mmol/L Tris · Cl(pH7.6) ， 0.5mol/L NaCl ， 1mmol/L EDTA(pH8.0) ， 0.1% SDS 。

4、洗脫緩沖液： 10mmol/L Tris · Cl (pH7.6) ， 0.05% SDS 。  

  四、動(dòng)植物總 RNA 提取操作步驟 

（一）動(dòng)植物總  RNA 提取 -Trizol  法  Trizol  法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用  Trizol 法提取的總 RNA 無蛋白和 DNA  污染。 RNA 可直接用于  Northern  斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交， Poly(A)+  分離，體外翻譯，RNase 封阻分析和分子克隆。

1、將組織在液  N  中磨成粉末后，再以  50-100mg  組織加入  1ml Trizol  液研磨，注意樣品總體積  不能超過所用 Trizol  體積的  10%。

2、研磨液室溫放置  5 分鐘，然后以每  1mlTrizol  液加入  0.2ml  的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用  手劇烈搖蕩離心管 15  秒。 

3 、取上層水相于一新的離心管，按每 mlTrizol  液加 0.5ml  異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置  10  分鐘， 12000g  離心  10  分鐘。

4、棄去上清液，按每  ml Trizol  液加入至少  1ml  的比例加入  75% 乙醇，渦旋混勻， 4 ℃下  7500g  離心  5  分鐘。

5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥  5-10  分鐘，注意不要干燥過分，否則會(huì)降低  RNA 的  溶解度。然后將  RNA  溶于水中，必要時(shí)可  55 ℃ -60 ℃水溶  10  分鐘。 RNA  可進(jìn)行  mRNA  分離，或貯 存于 70%乙醇并保存于-70℃。

[注意 ]

 1、整個(gè)操作要戴口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。

2、加氯仿前的勻漿液可在 -70 ℃保存一個(gè)月以上， RNA  沉淀在  70% 乙醇中可在  4 ℃保存一周， -20  ℃保存一年。 

（二） mRNA 提取  由于  mRNA  末端含有多  poly(A)+ ，當(dāng)總  RNA  流徑  oligo(dT) 纖維素時(shí)，在高鹽緩沖液作用下，  mRNA 被特異的吸附在  oligo(dT) 纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中， mRNA 可被洗下，經(jīng)過兩次 oligo(dT)  纖維素柱，可得到較純的  mRNA 。

  1、用  0.1mol/L NaOH  懸浮  0.5-1.0g oligo(dT) 纖維素。 

2 、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng) DEPC  處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯 德吸管中，柱床體積為  0.5-1.0ml，用  3  倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。

3、用  1x  柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的  pH 值小于  8.0 。 

4 、將（一）中提取的 RNA  液于 65 ℃溫育  5  分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積  2x  柱層析緩沖  液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當(dāng)所有  RNA 溶液進(jìn)入柱床后，加入  1 倍柱床體積的  1x  層析 柱加樣溶液。 

5 、測(cè)定每一管的 OD260 ，當(dāng)洗出液中  OD  為  0  時(shí)，加入  2-3  倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以 1/3  至 1/2  柱床體積分管收集洗脫液。

6、測(cè)定  OD260 ，合并含有  RNA  的洗脫組分。

7、加入  1/10  體積的  3M NaAc(pH5.2) ，  2.5  倍體積的冰冷乙醇， 混勻，  -20 ℃ 30  分鐘。

8、 4 ℃下  12000g  離心  15  分鐘，小心棄去上清液，用  70% 乙醇洗 滌沉淀， 4 ℃下  12000g  離心  5  分鐘。

9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥  10 分鐘，或真空干燥  10  分鐘。

10、用少量水溶解  RNA  液，即可用于  cDNA  合成（或保存在  70% 乙醇中并貯存于 -70 ℃）。

當(dāng)然，如果使用天根或碧云天的動(dòng)植物組織 mRNA 提取試劑盒也會(huì)省去很多步驟，節(jié)約實(shí)驗(yàn)耗材成本。

[注意 ]

? 1、 mRNA 在  70% 乙醇中 -70 ℃可保存一年以上。

2、 oligo(dT) 纖維素柱用后可用  0.3mol/l NaOH  洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入  0.02% 疊氮鈉（ NaN3) 冰箱保存，重復(fù)使用。每次用前需用 NaOH  水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。