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SDS-PAGE 膠染色介紹

一、各種蛋白染色方法的靈敏度比較二、考馬斯亮藍染色CBB染色液0.5%考馬斯亮藍G250或R25040%甲醇10%乙酸將CBB溶于甲醇中并不停的攪拌15min。加入乙酸與ddH2O脫色液：30%甲醇10%乙酸染色方法：1.在搖床上染色30min.2.脫色至蛋白點或條帶清晰可見3.ddH2O洗3-5次三、膠體考馬氏亮藍染色ColloidalCoomassieStaining（Cambridgecentreforporteomics）sensitivity=~100ng1.固定：...

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雙向電泳的樣品的制備及電泳實驗步驟

樣品制備原則樣品制備是雙向電泳中最關(guān)鍵的一步，將直接影響2-DE結(jié)果好壞。目前并沒有一個通用的樣品制備方法，盡管處理方法多種多樣，但都遵循幾個基本的原則：1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提最大量的總蛋白，減少蛋白質(zhì)的損失；2）減少對蛋白質(zhì)的人為修飾；3）破壞蛋白質(zhì)與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質(zhì)處于變性狀態(tài)。根據(jù)這一原則，樣品制備需要四種主要的試劑：離液劑(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性劑（sufactants）...

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免疫熒光標記法

免疫熒光標記法1、細胞膜上的免疫熒光檢測法間接標記法1)制備單細胞懸液；2)細胞計數(shù)，取出1×106個細胞于試管中；3)用臺盼藍染色計活細胞數(shù)，要求活細胞數(shù)90～95%；4)在試管中加入一抗，（劑量按照說明書的要求），孵育30～60分鐘；5)PBS洗滌1～2次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清；6)加入二抗，孵育20～30分鐘；7)PBS洗一次，1500rpm，離心3分鐘，棄上清;8)加300μlPBS，上機檢測(若不能及時上機檢測，可加1ml1%多聚甲醛固定，可放置1周)...

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細胞凋亡檢測及分子生物學檢測步驟

細胞凋亡檢測及分子生物學檢測步驟：1、細胞DNA含量分布（由細胞DNA降解方式檢測細胞凋亡）收集已固定的單細胞懸液約5×105~1×106/ml；離心除去固定液，3mlPBS重懸細胞;使用低速離心機1500rpm離心，5分鐘，棄去PBS；加PI染液1ml，室溫避光20分鐘；調(diào)整細胞濃度5×105/ml；上機檢測。2、磷脂酰絲氨酸外翻分析檢測細胞凋亡1)常規(guī)制備單細胞懸液,用PBS洗兩次.(若為全血要先溶血),取約5×106個細胞，1500rpm離心,棄上清,用400μl1×B...

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瓊脂糖核酸電泳介紹

瓊脂糖核酸電泳步驟1.用蒸餾水將制膠模具和梳子沖洗干凈，放在制膠平板上，封閉模具邊緣，架好梳子；2.根據(jù)欲分離DNA片段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠：準確稱量瓊脂糖干粉，加入到配膠用的三角燒瓶內(nèi)，定量加入電泳緩沖液（一般20~30ml）；3.放入到微波爐內(nèi)加熱熔化。冷卻片刻，加入一滴熒光染料，輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液，倒入電泳槽中，待其凝固；4.室溫下30~45分鐘后凝膠全凝結(jié)，小心拔出梳子，將凝膠安放在電泳槽內(nèi)；5.向電泳槽中倒入電泳緩沖液，其量以沒過膠面1m...

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